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流式细胞术检测活性氧（ROS）的步骤通常包括以下几个关键环节，以下为详细操作指南：
一、实验原理
活性氧（ROS）探针（如DCFH-DA）可被细胞摄取，在细胞内酯酶作用下去乙酰化生成非荧光的DCFH。DCFH与ROS反应后，氧化生成荧光物质DCF，其荧光强度与ROS水平成正比，通过流式细胞术定量检测。
二、实验步骤
[一R] 细胞准备
- 细胞处理：根据实验设计对细胞进行处理（如药物刺激、氧化应激诱导等）。
- 细胞收集：用胰酶消化贴壁细胞，离心（1000 rpm，5分钟）后重悬于预热的PBS或无血清培养基中。
- 细胞密度调整：调整细胞密度至 10^6 /mL分装至EP管或96孔板。
[二R]ROS探针标记
- 探针选择：常用DCFH-DA（2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯），浓度一般为 10 μM（需预实验优化）。
- 染色步骤：
1. 将DCFH-DA用无血清培养基或PBS稀释至工作浓度（终浓度通常为5-20 μM）。
2. 加入探针溶液至细胞悬液中，37℃避光孵育 20-40分钟。
3. 离心去除多余探针，用预热的PBS洗涤细胞2次，重悬于新鲜培养基或PBS中。
[三R] 阳性/阴性对照设置
- 阳性对照：加入ROS诱导剂（如H₂O₂，终浓度100-500 μM，处理30分钟）。
- 阴性对照：
- 未染色细胞（检测自发荧光）。
- 探针标记但未处理的细胞（基线ROS水平）。
- 可选：加入抗氧化剂（如NAC、维生素C）预处理，验证探针特异性。
[四R]流式检测
- 仪器设置：流式细胞仪选用 FITC通道（Ex 488 nm, Em 525 nm）。
- 参数调整：
- 前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）圈选活细胞群体。
- 设置阈值排除碎片和死细胞。
- 调整电压使阴性对照荧光信号位于 10^1-10^3区间。
- 数据采集：每样本采集 10^4 个细胞，记录荧光强度。
[五R] 数据分析
- 使用FlowJo或同类软件分析：
1. 圈选目标细胞群（如活细胞）。
2. 统计各组的平均荧光强度（MFI）。
3. 通过阴性对照扣除背景，计算相对ROS水平（实验组MFI / 对照组MFI）。
三、注意事项
[一R]避光操作：ROS探针见光易分解，全程避光（从染色到检测）。
[二R]细胞活性：避免处理导致细胞死亡，建议同步检测细胞活性（如PI或7-AAD染色）。
[三R]探针浓度优化：不同细胞系对探针的负载效率差异较大，需预实验确定最佳浓度。